การส่องกล้องจุลทรรศน์ ชีวะ

กล้องจุลทรรศน์

             การส่องกล้องจุลทรรศน์นะค่ะ วันนี้มีสอบพอดีเลยอยากมาแชร์ความรู้ให้นะค่ะ 

กล้องจุลทรรศน์เป็นสิ่งประดิษฐ์ที่มีความสำคัญต่อมวลมนุษยชาติเราเป็นอย่างมาก ด้วยเป็นเครื่องมือมหัศจรรย์ที่นำมนุษย์ไปสู่การค้นพบกับมิติของโลกอีกมุมหนึ่งที่เต็มไปด้วยสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กนานาชนิด ไม่ว่าจะเป็นสาหร่าย โปรโตซัว แบคทีเรีย เห็ด รา แม้กระทั่งตัวการสำคัญที่ก่อให้เกิดโรคร้ายแรงแก่มนุษย์เรา ซึ่งมีขนาดไม่กี่ไมครอน เช่น ตัวอมีบา และไวรัสสายพันธุ์ต่างๆ ก็ยังสามารถมองเห็นกลไกลและลักษณะของตัวมันได้อย่างชัดเจน กล้องจุลทรรศน์จึงนับว่าเป็นสุดยอดของเครื่องประดิษฐ์ เพราะไม่เพียงแต่ช่วยให้เรามองเห็นสิ่งที่ตาคนเราไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่าแล้วยังช่วยในกระบวนการศึกษาโครงสร้างภายในของเนื้อเยื่อมนุษย์เพื่อนำไปประกอบการวินิจฉัยและการรักษาโรคต่างๆอีกมากมาย

โดยทั่วไปแล้ว คนที่มีสายตาปกติจะสามารถมองเห็นวัตถุที่มีขนาดเล็กที่สุดได้เพียงขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางไม่น้อยกว่า 0.1 มิลลิเมตร ส่วนวัตถุที่มีขนาดเล็กกว่านี้นั้น สายตาคนเราจะไม่สามารถมองเห็นได้ ดังนั้น นักวิทยาศาสตร์จึงได้คิดประดิษฐ์เครื่องมือที่ช่วยให้เราสามารถมองเห็นวัตถุที่สายตาคนเราไม่สามารถมองเห็นได้ และบุคคลแรกที่สามารถประดิษฐ์เครื่องมือที่ช่วยให้เราสามารถมองเห็นวัตถุเหล่านั้นได้ มีชื่อว่า Antony Van Leeuwenhoek เป็นชาวเนเธอร์แลนด์ ซึ่งได้บรรยายถึงพืชและสัตว์ขนาดจิ๋วที่ไม่อาจมองเห็นด้วยตาเปล่าเป็นครั้งแรก และเครื่องมือที่ Leeuwenhoek ประดิษฐ์ขึ้นมานั้น ใช้เพียงเลนส์นูนเพียงอันเดียว ทำให้ขยายวัตถุที่ดูให้ใหญ่ขึ้น แต่ประสิทธิภาพของกำลังขยายภาพยังต่ำ เครื่องมือที่ประดิษฐ์ขึ้นมานั้นถูกเรียกว่า “กล้องจุลทรรศน์เลนส์เดี่ยวหรือแว่นขยาย” ซึ่งสามารถขยายได้ถึง

Antony Van Leeuwenhoek 270 เท่า เขาใช้กล้องจุลทรรศน์ในการศึกษาหยดน้ำ จากบึง และแม่น้ำ และจากน้ำฝน ที่รองเก็บไว้ในหม้อ เห็นสิ่งมีชีวิต ชนิดเล็กๆ มากมาย คือ พบแบคทีเรีย สาหร่าย โปรโตซัว สัตว์น้ำขนาดเล็ก แล้วยังส่องดูสิ่งต่างๆ เช่น เม็ดโลหิตแดง เซลล์สืบพันธุ์ ของสัตว์เพศผู้ กล้ามเนื้อ เป็นต้น จึงได้ส่งข้อมูลเผยแพร่ ทำให้ได้ชื่อว่าเป็นคนพบ จุลินทรีย์เป็นคนแรก ต่อมา Robert Hooke ได้ปรับปรุงแก้ไขให้ดีขึ้น โดยเพิ่มในส่วนของแหล่งกำเนิดแสง (Flame) และเลนส์รวมแสง (Condenser) ช่วยในการรวมแสงให้เข้มขึ้น ซึ่งในปัจจุบันนี้ กล้องจุลทรรศน์มีหลายชนิดด้วยกัน และแบ่งตามแหล่งกำเนิดแสงได้เป็น 2 ชนิดคือ
1. กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสง (Light Microscope : LM)
2. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (Electron Microscope)

กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสง (LM) แบ่งออกเป็น 2 ชนิดด้วยกันคือ
1. กล้องจุลทรรศน์อย่างง่ายหรือแว่นขยาย (Compound Microscope or Magnifying glass) ซึ่งใช้เพียงเลนส์นูนเพียงอันเดียวเป็นตัวช่วยในการขยายวัตถุให้ดูใหญ่ขึ้น และภาพที่ได้จะเป็นภาพเสมือน

2. กล้องจุลทรรศน์เชิงซ้อน (Compound Light Microscope) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่มีระบบเลนส์ที่ทำหน้าที่ขยายภาพ 2 ชุดด้วยกัน คือ เลนส์ใกล้วัตถุ และเลนส์ใกล้ตา กล้องจุลทรรศน์เชิงซ้อนมีหลาย กล้องจุลทรรศน์ชนิดเลนส์เดี่ยวชนิด แต่ชนิดที่ใช้งานทั่วไปในห้องปฏิบัติการ
จะเป็นชนิด Light field Microscope หรือ Bright field Microscope หลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้คือ เมื่อแสงไฟจากหลอดไฟเป็นแหล่งกำเนิดแสงจะถูกรวบรวมแสงโดย condenser lens ไปตกที่วัตถุที่วางบนแท่นวางวัตถุ (Specimen stage) จากนั้นเลนส์ใกล้วัตถุ (objective lens) จะเป็นตัวขยายวัตถุให้ได้ภาพที่ใหญ่ขึ้น แล้วจะส่งต่อไปยัง เลนส์ใกล้ตา (ocular lens) เพื่อขยายภาพสุดท้าย

กล้องจุลทรรศน์ขยายภาพได้อย่างไร เลนส์ใกล้วัตถุ(Objective lens) เป็นเลนส์แรกที่ทำหน้าที่ขยายภาพให้ใหญ่ขึ้นและเป็นเลนส์ที่มีความยาวโฟกัสสั้นสั้น ดังนั้นวัตถุที่จะศึกษาจะต้องอยู่ห่างจากเลนส์วัตถุมากกว่าทางยาวโฟกัสเล็กน้อย เลนส์ใกล้วัตถุจะสร้างภาพแรกขึ้นมาเป็นภาพจริงหัวกลับขนาดขยาย โดยที่ตำแหน่งของภาพจะไปตกใกล้เลนส์ใกล้ตา (Ocular lens หรือ Eyepiece) ซึ่งใกล้เลนส์มากกว่าทางยาวโฟกัสของเลนส์ ทำให้เกิดภาพเสมือนหัวกลับขนาดขยาย 
ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศน์ชนิด Light field Microscope หรือ Bright field Microscope
กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการทั่วไป Light field Microscope หรือ Bright field Microscope

ส่วนประกอบต่างๆของกล้องจุลทรรศน์ชนิด Bright field Microscope
1. ฐาน (Base) เป็นส่วนที่ใช้ในการตั้งกล้อง ทำหน้าที่รับน้ำหนักทั้งหมดของกล้องจุลทรรศน์
2. ลำกล้อง (Body) เป็นส่วนที่เชื่อมอยู่ระหว่างเลนส์ใกล้ตากับเลนส์ใกล้วัตถุ ทำหน้าที่ป้องกันการรบกวนจากแสงภายนอก
3. แขน (Arm) เป็นส่วนยึดลำกล้องและฐานไว้ด้วยกัน เป็นตำแหน่งที่ใช้จับเวลาเคลื่อนย้ายกล้องจุลทรรศน์
4. แท่นวางวัตถุ (Specimen stage) เป็นแท่นสำหรับวางสไลด์ตัวอย่างที่ต้องการศึกษา มีลักษณะเป็นแท่นสี่เหลี่ยมตรงกลางมีรูให้ลำแสงจากหลอดไฟส่องผ่านไปยังวัตถุที่ต้องการศึกษา แท่นวางวัตถุนี้สามารถเลื่อนขึ้นเลื่อนลงได้
5. ที่หนีบสไลด์ (Stage clip) อยู่บนแท่นวางวัตถุมี 1 คู่ ใช้สำหรับหนีบสไลด์ให้ติดกับแท่นวางวัตถุ
6. ปุ่มปรับภาพหยาบ (Coarse adjustment) เป็นปุ่มขนาดใหญ่ ใช้ในการปรับหาระยะภาพ
7. ปุ่มปรับภาพละเอียด (Fine adjustment) เป็นปุ่มขนาดเล็ก ทำหน้าที่ในการปรับภาพให้ชัดเจนมากขึ้น
8. เลนส์ใกล้วัตถุ (Objective lens) เป็นเลนส์ขยายภาพที่อยู่ใกล้วัตถุ มีกำลังขยายต่างกัน กล้องแต่ละอันจะมี 3 เลนส์ คือ
- เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยายต่ำ (Lower power) กำลังขยาย 4X, 10X
- เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยายสูง (High power) 40X
- เลนส์ใกล้วัตถุแบบ Oil Immersion ขนาด 100X
ภาพที่เกิดจากเลนส์ใกล้วัตถุจะเป็นจริงหัวกลับ
9. เลนส์ใกล้ตา (Ocular lens หรือ Eyepiece lens) ทำหน้าที่ขยายภาพที่ได้จากเลนส์ใกล้วัตถุให้มีขนาดใหญ่ขึ้น ภาพที่ได้จะเป็นภาพเสมือนหัวกลับ
10. จานหมุน (Revolving nosepiece) ใช้หมุนเมื่อต้องการเปลี่ยนกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ
11. เลนส์รวมแสง (Condenser) จะอยู่ด้านใต้ของแท่นวางวัตถุ ทำหน้าที่รวมแสงให้เข้มขึ้นเพื่อส่งไปยังวัตถุที่ต้องการศึกษา
12. กระจกเงา (Mirror) ทำหน้าที่สะท้อนแสงจากธรรมชาติหรือจากหลอดไฟภายในห้องให้ส่องผ่านวัตถุ
13. ไอริส ไดอะแฟรม (Iris diaphragm) อยู่ใต้เลนส์รวมแสงทำหน้าที่ปรับปริมาณแสงให้เข้าสู่เลนส์ในปริมาณที่ต้องการ

ก

1. การจับกล้องและเคลื่อนย้ายกล้อง ต้องใช้มือหนึ่งจับที่แขนและอีกมือหนึ่งรองที่ฐานของกล้อง
2. ตั้งลำกล้องให้ตรง
3. เปิดไฟเพื่อให้แสงเข้าลำกล้องได้เต็มที่
4. หมุนเลนส์ใกล้วัตถุ ให้เลนส์ที่มีกำลังขยายต่ำสุดอยู่ในตำแหน่งแนวของลำกล้อง
5. นำสไลด์ที่จะศึกษามาวางบนแท่นวางวัตถุ โดยปรับให้อยู่กลางบริเวณที่แสงผ่าน
6. ค่อยๆหมุนปุ่มปรับภาพหยาบให้กล้องเลื่อนขึ้นช้าๆเพื่อหาระยะภาพ แต่ต้องระวังไม่ให้เลนส์ใกล้วัตถุกระทบกับสไลด์ตัวอย่าง เพราะจะทำให้เลนส์แตกได้
7. ปรับภาพให้ชัดเจนขึ้นด้วยปุ่มปรับภาพละเอียด ถ้าวัตถุที่ศึกษาไม่อยู่ตรงกลางให้เลื่อนสไลด์ให้มาอยู่ตรงกลาง
8. ถ้าต้องการให้ภาพขยายใหญ่ขึ้นให้หมุนเลนส์ใกล้วัตถุที่มีกำลังขยายสูงกว่าเดิมมาอยู่ในตำแหน่งแนวของลำกล้อง จากนั้นปรับภาพให้ชัดเจนด้วยปุ่มปรับภาพละเอียดเท่านั้น ห้ามปรับภาพด้วยปุ่มปรับภาพหยาบเพราะจะทำให้ระยะของภาพ หรือจุดโฟกัสของภาพเปลี่ยนไป
9. บันทึกกำลังขยายโดยหาได้จากผลคูณของกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุกับกำลังขยายของเลนส์ใกล้ตา


ข้อควรระวังในการใช้กล้องจุลทรรศน์
เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์เป็นอุปกรณ์ที่มีราคาค่อนข้างสูงและมีส่วนประกอบที่อาจเสียหายง่ายโดยเฉพาะเลนส์ จึงต้องใช้และเก็บรักษาด้วยความระมัดระวังให้ถูกวิธี ซึ่งมีวิธีปฏิบัติดังนี้
1. ในการยกกล้องและเคลื่อนย้ายกล้อง ต้องใช้มือหนึ่งจับที่แขนและอีกมือหนึ่งรองที่ฐานของ กล้อง
2. สไลด์และกระจกปิดสไลด์ที่ใช้ต้องไม่เปียก เพราะอาจจะทำให้แท่นวางวัตถุเกิดสนิม และเลนส์ใกล้วัตถุอาจขึ้นราได้
3. เมื่อต้องการหมุนปุ่มปรับภาพหยาบต้องมองด้านข้างตามแนวระดับแท่นวางวัตถุ เพื่อป้องกันการกระทบของเลนส์ใกล้วัตถุกับกระจกสไลด์ ซึ่งอาจทำให้เลนส์แตกได้
4. การหาภาพต้องเริ่มด้วยเลนส์ใกล้วัตถุที่มีกำลังขยายต่ำสุดก่อนเสมอ
5. เมื่อต้องการปรับภาพให้ชัดขึ้นให้หมุนเฉพาะปุ่มปรับภาพละเอียดเท่านั้น เพราะถ้าหมุนปุ่มปรับภาพหยาบจะทำให้ระยะภาพหรือจุดโฟกัสของภาพเปลี่ยนไปจากเดิม
6. ห้ามใช้มือแตะเลนส์ ควรใช้กระดาษเช็ดเลนส์ในการทำความสะอาดเลนส์
7. เมื่อใช้เสร็จแล้วต้องเอาวัตถุที่ศึกษาออก เช็ดแท่นวางวัตถุและเช็ดเลนส์ให้สะอาด หมุนเลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยายต่ำสุดให้อยู่ตรงกลางลำกล้อง และเลื่อนลำกล้องลงต่ำสุด ปรับกระจกให้อยู่ในแนวตั้งฉากกับแท่นวางวัตถุเพื่อป้องกันไม่ให้ฝุ่นเกาะ แล้วเก็บใส่กล่องหรือตู้ให้เรียบร้อย

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (Electron Microscope: EM)
Ernst Ruskaกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเป็นเครื่องมือที่พัฒนามาจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา เหตุผลที่ทำให้ประดิษฐ์เครื่องมือนี้ขึ้นมาก็ เนื่องจากว่า ประสิทธิภาพในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง
Max Knoll ธรรมดานั้นไม่สามารถศึกษารายละเอียดของโครงสร้างภายในของสิ่งมีชีวิตและสิ่งที่มีขนาดเล็กมากๆอย่างเช่น ดีเอ็นเอ(Deoxyribo nucleic acid : DNA) ก็ไม่สามารถมองเห็นได้ และเครื่องมีนี้ได้ประดิษฐ์ขึ้นครั้งแรกในประเทศเยอรมนี ในปีค.ศ.1932 โดยนักวิทยาศาสตร์ 2 ท่าน คือ แมกซ์ นอลล์ (Max Knoll) และ เอิร์นสต์ รุสกา (Ernst Ruska) ซึ่งแสงที่ใช้เป็นลำแสงอิเล็กตรอน ที่มีขนาดของความยาวคลื่นประมาณ 0.025 อังสตรอม (oA) มีกำลังขยายถึง 500,000 เท่า หรือมากกว่า
แหล่งกำเนิดแสงอิเล็กตรอนได้จากปืนยิงอิเล็กตรอน (Electron gun) ซึ่งเป็นขดลวดทังสเตน มีลักษณะเป็นรูปตัววี เมื่อขดลวดทังสเตนรั้นขึ้นโดยการเพิ่มกระแสไฟฟ้าเข้าไปในขดลวด ทำให้อิเล็กตรอนถูกปลดปล่อยออกมาจากขดลวดทังสเตน เนื่องจากอิเล็กตรอนมีขนาดเล็กมาก และเพื่อเป็นการป้องกันการชนกันของมวลอากาศกับลำแสงอิเล็กตรอน ซึ่งจะทำให้เกิดการหักเหได้ จึงต้องมีการดูดอากาศจากตัวกล้องให้เป็นสุญญากาศ
ระบบเลนส์ที่ใช้เป็นระบบเลนส์แม่เหล็กไฟฟ้า (Electromagnetic lens) แทนเลนส์แก้วในกล้องจุลทรรศน์ชนิดแสงธรรมดา เลนส์แม่เหล็กไฟฟ้าประกอบด้วยขดลวดพันรอบแท่งเหล็ก เมื่อกระแสไฟฟ้าผ่านเข้าไปทำให้เกิดสนามแม่เหล็กขึ้น สนามแม่เหล็กไฟฟ้าจะทำให้ลำแสงอิเล็กตรอนเข้มขึ้น เพื่อไปตกกระทบกับตัวอย่างวัตถุที่จะศึกษา เลนส์ของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนประกอบด้วยเลนส์รวมแสง (Objective lens) และ Projector Lens โดยที่ Projector lens ทำหน้าที่ฉายภาพจากวัตถุ Electron Microscope ตัวอย่างที่จะศึกษาลงบนจอภาพคล้ายกับ Eyepiece ของกล้องจุลทรรศน์ชนิดแสงธรรมดา จอภาพฉาบด้วยสารเรืองแสงพวกฟอสฟอรัส เมื่อลำแสงอิเล็กตรอนตกลงบนจอ จะทำให้เกิดการเรืองแสงขึ้นซึ่งเป็นสารสีเขียวแกมเหลืองที่มองได้ด้วยตาเปล่า สามารถบันทึกภาพได้ดังรูป

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
(Electron Microscope)

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในปัจจุบันมี 2 ชนิดด้วยกัน
1. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องผ่าน (Transmission Electron Microscope: TEM)

เอิร์นสต์ รุสกา สร้างสำเร็จเป็นคนแรก ในปี ค.ศ.1932 ใช้ในการศึกษาโครงสร้างภายในของเซลล์โดยลำแสงอิเล็กตรอนจะส่องผ่านเซลล์ หรือวัตถุตัวอย่างที่ศึกษา ซึ่งต้องมีลักษณะบางเป็นพิเศษ ขั้นตอนในการเตรียมตัวอย่างที่ศึกษายุ่งยาก

หลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องผ่าน
ลำแสงอิเล็กตรอนเกิดจากการผ่านกระแสไฟฟ้าแรงสูง เข้าไปในขดลวดทังสเตน (Tungsten filament) ทำให้มีอิเล็กตรอนวิ่งออกมาจากส่วนปลายของ filament จากนั้นจะวิ่งตรงไปยังวัตถุ ซึ่งลำแสงอิเล็กตรอนที่วิ่งผ่านวัตถุจะวิ่งไปยังเลนส์ใกล้วัตถุ (Objective lens) และจะถูกขยายสัญญาณให้ใหญ่ขึ้นโดย Objective lens สุดท้ายอิเล็กตรอนจะไปกระตุ้นโมเลกุลของซิงค์ซัลไฟด์ (Zinc sulfide) ที่ฉาบอยู่บนฉากรับภาพ (Fluorescence screen) ทำให้เกิดเป็นภาพ 2 มิติ โดยที่วัตถุที่มีค่าเลขอะตอม (Atomic number) มากนั้น ภาพที่ได้จะเห็นเป็นสีดำ ส่วนวัตถุที่มีค่าเลขอะตอมน้อย ภาพที่เห็นจะเป็นสีขาว

2. กล้องจุลทรรศน์ชนิดส่องกราด (Scanning Electron Microscope: SEM)
เอ็ม วอน เอนเดนนี (M Von Andenne) สร้างเสร็จในปี ค.ศ. 1938 โดยใช้ศึกษาผิวของเซลล์หรือผิวของตัวอย่างวัตถุที่นำมาศึกษา โดยลำแสงอิเล็กตรอนจะส่องกราดไปบนผิวของวัตถุ ทำให้ได้ภาพซึ่งมีลักษณะเป็นภาพ 3 มิติ

หลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด
เกิดจากการที่ Primary electron วิ่งไปกระทบพื้นผิวของวัตถุ ทำให้มีการสะท้อนกลับของพลังงานในรูปแบบต่างๆ เช่น back-scatter electron, รังสีเอ็กซ์ (X-ray) หรือ secondary electron เป็นต้น และในลำกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด จะมีตัวรับสัญญาณที่ทำหน้าที่รับและเปลี่ยน secondary electron ให้เป็นสัญญาณอิเล็กตรอน (electrical signal) แล้วส่งสัญญาณไปยังจอภาพ (Cathode ray tube) เพื่อทำให้เกิดภาพที่ตามองเห็นได้ โดยภาพที่ออกมานั้นจะมีลักษณะ 3 มิติ จากนั้นจะบันทึกภาพลง Photographic